Page 44 - 动物生物技术与繁殖研究

动物生物技术与繁殖研究
Research on Animal Biotechnology and Reproduction

家标准之一。单松华等针对 H5 亚型 AIVHA 基因序列，设计了 2 条特异性引物
以及捕捉探针和电化学发光检测探针，优化 NASBA 检测方法。在对不同亚型
AIV、不同宿主来源 NDV、鸭瘟病毒、SPF 鸡胚尿囊液以及常规禽病疫苗等 21

份样品进行检测时，能特异性检测出 H5 亚型 AIV，灵敏度比 HA 高 105 倍。在
人工感染鸡的 101 份粪拭子、血液和组织脏器的检测中，NASBA 法与病原分离
法符合率达 90%（87/97），说明该法可用于 AIV 的快速检测及口岸检疫。为了
缩短检测时间，使操作更加标准化，Collins 等开发了基于 M 基因和 HA 基因的

NASBA/ECL 试剂盒，可特异性检测 H7 亚型，其灵敏度比常规的免疫检测方法
高 10~100 倍。另外，NASBA 技术在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、新冠病
毒肺炎、肝炎等疾病诊断中的应用已见相关报道，由于其反应体系复杂，检测成
本过高，目前在 AIV 的检测与研究中应用并不多，但凭借其操作简单、高特异

性和敏感性的特点，在动物疫病检测方面具有良好的发展前景。
（2）逆转录－环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（LAMP）技术是 2000 年 Notomi 等开发的一种新型的
等温核酸扩增技术，利用至少 2 对特异性引物识别靶基因的 6 个特定区域，通过

具有链错位活性的 Bst 聚合酶催化扩增反应，在 60℃ ~70℃的恒温条件下，可快
9
10
速将目的基因扩增 10 ~10 倍，整个过程只需要在恒温水浴锅内即可完成。并且
扩增产物具有可视化特点，可通过反应体系颜色变化、凝胶成像或浊度仪进行
判断。对于 AIV 等 RNA 病毒，只需加入反转录酶即可检测。该方法操作简单，

结果可视，在已经建立的方法中，与实时荧光定量 RT-PCR 和 RT-PCR 相比，
也具有更高的特异性和灵敏度。Zeinab 等设计了针对 H6 和 H9 亚型 HA 基因的
LAMP 引物各 2 对，建立了快速检测 H6 和 H9 亚型 AIV 的 RT-LAMP 方法。在
对 33 株不同亚型 AIV 和其他病毒进行检测时，只有 H6 和 H9 亚型 RNA 样品在

反应后体系由橙色变为绿色，证明该方法具有良好的特异性。两种亚型 AIV 检
测限均为 10 拷贝，是实时荧光定量 RT-PCR 的 100 倍，RT-PCR 的 1000 倍，80
份野外样本的检测也证实 RT-LAMP 比 RT-PCR 更加敏感（阳性数 34/26）。
李云燕等根据 H9N2AIV 的 HA 和 NA 基因保守序列设计 2 对特异性引物和

2 条探针，建立利用探针 5′端的荧光基团在多色荧光成像仪下观察是否有荧光
来判断核酸扩增情况，并且不同扩增产物显示不同颜色。结果显示二重荧光 RT-
LAMP 方法仅特异性扩增 H9 亚型 HA 基因和 N2 亚型 NA 基因，对其他亚型均

30