Page 151 - 动物生物技术与繁殖研究

第六章 人类疾病动物模型的发展

第六章 人类疾病动物模型的发展

第一节 基因编辑技术的应用

随着 ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 等特异性人工核酸酶技术的发展，基因

编辑从早期的基因打靶逐渐发展为以特异性核酸酶为基础的完善的基因编辑技术
体系。目前广泛应用的主要是基于 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑技术，通过这
些技术可以实现高效的基因敲除（Knock-out，KO）、敲入（Knock-in，KI）、
精确的点编辑（Point Editing，PE）以及单碱基编辑（Base Editing，BE）。早期

的基因打靶通过打靶载体与胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）中目标基因
位点的自发同源重组实现外源基因的敲入，然后把成功打靶的 ES 细胞移植回囊
胚，通过胚胎移植制备转基因动物。该技术存在着效率低、周期长、费用高以及
嵌合体等缺点。随后人们发现，通过大型核酶在目标基因位点引入 DNA 双链断

裂后，能够大大提高打靶载体的重组效率，进而有效提高基因打靶的效率。
为了能够定制特异性识别基因组 DNA 靶序列的核酸内切酶，人们相继开
发了基于锌指蛋白（ZFP）和转录激活因子样效应物（TALE）的 ZFNs 技术和
TALENs 技术。这两种技术分别通过 ZFP 和 TALE 重复单元识别目标基因靶序

列，由与之融合的核酸内切酶 Fok Ⅰ结构域进行 DNA 定点切割，进而通过基因
组 DNA 的自发或诱导修复实现基因编辑。但是，ZFNs 和 TALENs 核酸酶的构
建过程繁琐且活性并不能得到有效保证。CRISPR/Cas9 技术由负责靶向的导向
RNA（sgRNA 或 gRNA）和负责切割的 Cas9 核酸酶组成，相比于传统的 ZFNs

和 TALENs 技术更为简单，只需要针对特定靶序列设计构建相应 sgRNA，便能
实现高效的 DNA 切割，进而介导有效的基因编辑。除了 CRISPR/Cas9 系统，广
泛应用于基因编辑的 CRISPR/Cas 系统还有 CRISPR/Cas12a 和 CRISPR/Cas12b。
CRISPR/Cas 技术由于操作简便、成本低和效率高等优点，受到了科研工作

者们的广泛青睐，但同时也存在着脱靶效应的问题。Baseeditor（BE）技术是在
CRISPR/Cas9 的基础上发展出来的单碱基编辑技术，能够在不引入 DNA 双链断

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