Page 160 - 动物生物技术与繁殖研究

动物生物技术与繁殖研究
Research on Animal Biotechnology and Reproduction

术用于生产基因修饰兔，如转座子、慢病毒转染等，但是这些技术只是提高了生
产效率，对于精确的基因操作还无法完成。直到 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9
等新型的基因编辑技术出现。目前，这些技术已经被广泛用于基因的改造并取得

一定的成就。尤其是 CRISPR/Cas9 技术的出现，使得精准的基因修饰效率获得
极大的提高，并将基因修饰动物的研发带入了一个高速发展的道路。为了表彰
CRISPR/Cas9 技术在基因编辑域的突出贡献，该技术于 2020 年获得了诺贝尔化
学奖。

（二）核酸酶介导的基因修饰兔
较早出现的一类核酸酶叫作归巢核酸内切酶（meganuclease），识别位点高
达 12~40 个碱基对，具有高度的特异性，但是较大的识别位点限制了可编辑基
因的范围，从而也限制了大范围应用。目前，常用的基因编辑核酸酶主要有 3

种 ZFN、TALEN 和 CRISPRo 这 3 种核酸酶都能对目标基因进行编辑，尤其是
CRISPR 编辑的效率以及操作的简便程度要明显优于其他两种。人们利用核酸酶
在目标位点产生 DNA 双链断裂（Double-strand Breaks，DSB），然后通过不同
的修复机制来实现基因的插入或敲除。DSB 的修复方式主要包括两种，一种是

非同源末端连接（Non-homologous End Joining，NHEJ），这是一种错误率较高
的修复方式，不需要模板，但容易形成移码突变、终止密码子提前，从而导致蛋
白质编码序列的中断曲折，而另一种则是可以通过模板进行精准修复的同源末端
重组（Homology Directed Repair，HDR），这种修复机制可以精准地插入特定的

序列，是研究基因敲入的重要方向，但与 NHEJ 途径相比，HDR 的效率较低。
因此，近年来人们一直在探索增强 HDR 的调控机制。ZFN、TALEN、CRISPR
等基因编辑工具的应用促进了基因修饰兔的发展，现如今也发展出多种利用编
辑系统产生的兔人类疾病模型。接下来我们将主要讨论这三种核酸酶在兔中的

应用。
1. 锌指核酸酶（ZFNs）
由于传统的基因编辑技术准确度低、操作困难，迫使人们急需更方便准确的
基因编辑方法，因此研究人员开发出一种工程核酸酶 ZFN。ZFNs 由一个 DNA

识别域以及 DNA 剪切域组成，当两个 ZFN 结合到相应的基因位点时，两个
FokI 单体相互作用形成二聚体产生酶切功能，形成断裂双链从而介导 DNA 的特
定剪切呦。在 2011 年 ZFN 首次被 Flisikowska 等应用于兔，首次将兔的免疫球

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