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动物生物技术与繁殖研究
Research on Animal Biotechnology and Reproduction

（三）分子生物学检测方法
1. 变温扩增技术
（1）RT-PCR 检测技术

PCR 是最常用的体外扩增 DNA 序列的分子生物学方法之一，广泛应用于各
类核酸检测。RT-PCR 是将 RNA 的逆转录和 cDNA 的扩增相结合，极大提高了
RNA 检测效率，广泛用于 AIV 的核酸检测。与病毒分离鉴定相比，本法操作简便，
一般检测时间 1~6h，具有高度的特异性和灵敏度，适用于疾病早期诊断。鉴于

AIV 亚型多，研究者以同时检测多种亚型的多重 RT-PCR 为主要研究方向，李丹
等通过分析 Gen Bank 中 H9 和 H10 亚型 AIV HA 基因的保守序列，设计了 2 对
引物，建立了二重 RT-PCR 方法，可同时检测 H9 和 H10 亚型 AIV，最低检测限
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为 5×10 拷贝 /μL，在南宁地区 120 份临床样品检测中结果符合率达 100%。罗
思思等对 H4 亚型 AIV HA 基因、N2 亚型 AIV NA 基因和所有亚型 AIV 的 M 基
因保守序列进行分析，设计并筛选出 3 对特异性引物，建立了三重 RT-PCR 检测
方法，能检测到 6pg/μL 的病毒 RNA，对 185 份临床样品的检测结果与病毒分离、
HI 结果完全一致。多重 PCR 不仅可以同时检测不同亚型 AIV，也可以同时检测

不同病原。奉彬等建立了可同时检测新城疫病毒（NDV）、鸡细小病毒和 AIV
的三重 PCR 方法，能特异检测以上 3 种病原，具备良好的敏感性和重复性。因此，
凭借其特异、敏感、快速等优点，RT-PCR 仍是快速检测、鉴定 AIV 的重要技术
手段。

（2）实时荧光定量 RT-PCR 检测技术
1996 年，美国 Applied Biosystems 公司首次使用实时荧光定量 PCR 技术，
以 PCR 为基础，加入荧光基团，以荧光信号出现的先后以及强弱检测核酸扩增
的过程、分析样品基因的量，通过与标准品的对比达到实时定量的目的。该技术

与传统的 RT-PCR 相比，灵敏度、特异性更高，而且可定量，在 mRNA 表达、
DNA 拷贝数检测、细胞因子表达等领域得到广泛应用。
目前，使用的荧光物质主要为荧光染料，如 SYBR Green Ⅰ、SYBRGreen
ER 等，以及荧光探针，如 Taq Man 探针、分子信标、Light Cycler 技术等。其
中，探针法是目前最常用的方法之一，Payungporn 等通过 M 基因、H5 亚型 HA

基因和 N1 亚型 NA 基因保守序列设计引物及 TaqMan MGB 探针，建立一步多重
实时荧光定量 RT-PCR 法，通过检测三重荧光信号达到鉴定 H5N1 亚型 AIV 的目

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