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动物生物技术与繁殖研究
Research on Animal Biotechnology and Reproduction

此外，也可将 RPA 与其他检测方法结合，提高检测效率，李翔等建立了 RT-
RPA 结合侧流层析试纸条，用于快速检测 H7 亚型 AIV。与 RT-LAMP 法相比，
RPA 具有相当的特异性和操作简便性，虽然其灵敏度稍差，但其检测时间更短，

反应温度更低，所以，RPA 也是快速检测 AIV 的方法之一。
（4）依赖解旋酶的等温扩增技术
依赖解旋酶的等温扩增技术（Helicase Dependent Amplification，HDA）是
NEB 公司推出的新型核酸等温扩增技术，模拟 DNA 体内复制过程，利用解旋酶

打开双链 DNA，解旋的模板单链在单链结合蛋白 SSB 的作用下，与引物杂交，
通过 DNA 聚合酶的催化进行快速扩增。仅需水浴锅即可扩增，75~90min 可将靶
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基因扩增 10 倍。对于 RNA 病毒，加入热稳定逆转录酶就能实现 RT-HAD 检测。
方斌等针对 HA 基因设计的引物，以 FITC 和 Biotin 标记，建立以胶体金免疫层

析试纸检测扩增产物的 RT-HAD 方法，特异性高，检测限达 20 拷贝 /μL，实现
现场快速检测 H7N9 亚型 AIV。但目前对 HAD 的研究较少，技术仍不成熟，在
体外基因扩增方面的应用需加大研究，在 AIV 的现场检测方面将具有巨大的应
用空间。

3. 基因芯片
基因芯片（Gene Chip）又称为 DNA 芯片、DNA 微阵列（DNA Microarray），
是一种新型高通量自动化基因检测技术。传统的基因芯片技术包括 cD-NA 芯片
和寡核苷酸芯片，将大量已知的 DNA 片段或寡核苷酸探针按一定顺序和规律固

定于固相载体，待测样品通过荧光染料或放射性同位素进行标记，然后进行杂
交，利用基因芯片扫描仪对不同强度的荧光信号进行分析，从而得到目的基因数
据。但是基因芯片扫描仪价格昂贵，研究者们通过加入酶、纳米金等显色技术逐
渐实现了基因芯片可视化。在临床研究应用中，由于寡核苷酸基因芯片法杂交效

率更高，特异性更高，因此应用更广。Wang 等建立了一套寡核苷酸基因芯片法，
通过分析 H5 亚型 AIVHA 基因裂解位点碱性氨基酸，实现了通过肉眼观察结果
对病毒毒力进行分型，检测灵敏度为 RT-PCR 的 1000 倍。Xiao 等建立了可同时
检测 AIV（H5、H7、H9）、NDV、IBV 的寡核苷酸基因芯片，与其他禽类病原

无交叉反应，特异性良好，对 AIV 检测限为 0.1EID 50 /0.1mL，93 个临床样本阳
性检出率高于 RT-PCR（31/28）。寡核苷酸基因芯片法中，使用荧光标记物进行
检测的方法最成熟，常用的荧光染料有 Cy3、Cy5 等。Sultankulova 等通过 Cy5

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