Page 45 - 动物生物技术与繁殖研究
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第二章 病毒性动物疫病防控
为阴性反应；敏感性测试表明检测限为 100 拷贝 /μL；180 份临床咽拭子和泄殖
腔拭子检测结果与病毒分离法符合率达 95%。在保证检测方法灵敏度、特异性的
基础上，研究者们进一步缩短了检测时间，极大提高了检测效率，Shi 等建立了
针对 H1~H16 亚型 AIVM 基因的 RT-LAMP 方法，通过 2 对特异性引物在 30min
内完成靶基因扩增，扩增产物直接通过荧光素进行识别，对 H1、H5、H7 和 H9
亚型的检测限达 0.1PFU，比 RT-PCR 高出 10 倍；335 份临床样本检测结果也显
示 RT-LAMP 的灵敏度优于 RT-PCR（阳性数 14/12）。
Zhang 等开发了鉴定 H5 和 H9 亚型 AIV 的 RT-LAMP 方法，共设计 3 对引物，
1 对针对 M 基因筛选 AIV，另外 2 对引物则特异性区分 H5 和 H9HA 基因。该方
法比 RT-PCR 快 4 倍，灵敏度高 10 倍。但是在 RT-LAMP 检测中发现核酸扩增易
造成遗留污染，为了解决该问题，Kim 等开发了一种通过尿嘧啶 -DNA 糖基化酶
处理的 RT-LAMP 方法（uRT-LAMP），虽然会导致灵敏度降低，但能有效防止
DNA 污染产生假阳性结果。综上所述，RT-LAMP 法在检测特异性、灵敏度上与
实时荧光定量 RT-PCR 和 RT-PCR 相当，但其操作更加简便，并且无需特殊核酸
扩增设备，使其在 AIV 现场检测与快速检测中得以更广泛地应用。
（3）重组酶聚合酶介导的等温扩增技术
重组酶聚合酶介导的等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，
RPA）由英国剑桥 TwistDx 公司推出，被认为是可以替代 PCR 的新型等温核酸
扩增技术。反应体系主要包括：针对靶基因的 2 条特异性引物、DNA 模板、双
蒸水以及 3 种关键蛋白（重组酶、单链结合蛋白 SSB、DNA 聚合酶），此外，
还包括辅助成分 DNA 聚合酶、提供能量的三磷酸腺苷、磷酸肌酸、酶的辅助因
子醋酸镁等，该反应只需在 37℃ ~42℃即可发生，扩增过程仅需 60min，多数情
况下 10~15min 就能完成。扩增产物要求小于 500bp，产物可通过凝胶电泳、荧
光进行检测。RPA 需要在反应中筛选最适引物和反应温度以达到较高的特异性和
灵敏度，Yehia 等开发了一种用于检测 H9N2 AIV 的 RT-RPA 方法。该方法具有
高度特异性，在检测包括 H9N2 AIV、H5N2 AIV、H7N1 AIV、传染性喉气管炎
病毒（ILTV）、IBV、NDV、支原体以及阴性样品时，仅检测到 H9N2 AIV 能产
生特异性扩增；此外，该方法也具有良好的灵敏度，反应 5~8min 最低检测限为
1EID50/mL。陈泓锦等建立的检测 H5N1 AIV 实时荧光 RT-RPA 方法，具备高特
异性，灵敏度与 RT-PCR 相当，可满足现场快速检测。
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