Page 43 - 动物生物技术与繁殖研究
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第二章 病毒性动物疫病防控
的。该方法具有高度特异性，在 75 份临床样本检测中，与 NDV、传染性支气管
炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、呼吸道合胞病毒（Respiratory
Syncytial Virus，RSV）以及对照尿囊液等均无交叉反应，与其他亚型的 AIV 可
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通过不同的荧光信号进行鉴别；同时具有高度的敏感性（检测限为 10 ~10 拷
贝 /μL）。此外，研究者通过设计针对 AIV 不同基因的探针，建立多重实时荧光
定量 RT-PCR，检测不同亚型 AIV，均具备较好的灵敏度和特异性。彭程等针对
H5 亚型 AIV2.3.2.1 分支和 2.3.4.4 分支毒株的 HA 基因设计了 2 条特异性探针，建
立了鉴定这两个分支不同毒株的检测方法，100 份临床样本检测结果与病毒分离
5.0
结果符合率达 100%，2.3.2.1、2.3.4.4 分支毒株检测灵敏度分别达到 49 拷贝 /μL
2.3
和 2 拷贝 /μL。雷宇平等合成了针对 H7 亚型 HA 基因及 N9 亚型 NA 基因的特
异性 TaqMan 探针，建立了快速检测 H7N9 亚型 AIV 的实时 RT-PCR 方法，在对
第二代人感染 H7N9 亚型流感病毒国家参考品检测中，其特异性达 100%，检测
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限达 1.7×10 拷贝 /mL。王素春等对 AIVM 基因和 H5、H7、H9 亚型的 HA 基
因进行分析并设计探针，建立四重荧光 RT-PCR 方法，不仅可以检测 AIV，还能
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对 H5、H7、H9 亚型进行鉴别，其检测下限为 10 ng/μL，临床样品检测结果与
RT-PCR 检测结果 100% 符合。除了检测不同亚型 AIV 之外，实时荧光定量 RT-
PCR 也可以同时检测不同病原，Zhang 等对 AIVM 基因、NDVF 基因和坦布苏
病毒 E 基因的高度保守序列进行分析，设计探针，建立了检测鸭源 AIV、鸭源
NDV 和坦布苏病毒的三重实时荧光定量 RT-PCR 法，具有高度特异性（120 份
临床样本阳性符合率 85% 以上，阴性符合率 100%）和灵敏度（3 种病毒检测限
均达 10 拷贝 /μL，是 RT-PCR 的 10 倍）。探针法比荧光染料法具有更高的灵敏
度与准确率，且探针法应用更广。实时荧光定量 PCR 需要价格昂贵的荧光定量
PCR 仪，手工操作步骤较多，易造成污染，不利于在基层以及现场检测中使用。
2. 等温扩增技术
（1）依赖核酸序列的扩增技术
依赖核酸序列的扩增技术（Nuclear Acid Sequence-based Amplification，
NASBA）是一种以 RNA 为模板，使用 AMV 反转录酶、RNA 酶 H、噬菌体
T7RNA 聚合酶以及两条特异性引物进行的等温核酸扩增技术，自 1991 年被报
道后，广泛用于 RNA 的检测。操作简单，扩增效率高，反应体系在 42℃恒温
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条件下 2~4h 即可将模板 RNA 扩增 10 ~10 倍。该方法也是我国诊断 AIV 的国
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